梨火疫病菌监测调查方法(试行)

各省、自治区、直辖市植保(植检、农技)站(局、处、中心)，天津市、辽宁省农业发展服务中心，新疆生产建设兵团农技推广总站：

根据农业农村部公告第351号，梨火疫病菌、马铃薯金线虫、玉米褪绿斑驳病毒等3种有害生物新增补为全国农业植物检疫性有害生物。为做好新增补有害生物监测工作，我中心组织制定了《梨火疫病菌监测调查方法(试行)》《马铃薯金线虫监测调查方法(试行)》《玉米褪绿斑驳病毒监测调查方法(试行)》，现印发各地试行。试行中相关问题建议请及时反馈我中心植物检疫处。

联 系 人：王晓亮

电 话：010—59194757

电子邮箱：njzxjyc@capq.cn。

梨火疫病菌监测调查方法(试行)

为做好梨火疫病菌(Erwinia amylovora Burrill et al.)监测调查工作，制定本方法。

一、监测区域

梨火疫病菌发生县(区)及传入风险高的未发生县(区)。发生县(区)重点监测有代表性果园和边缘区果园，未发生县(区)重点监测寄主作物采穗圃和苗圃、与发生县(区)相邻的周边果园等。监测调查作物包括梨、苹果、杜梨、山楂、海棠、榅桲等蔷薇科果树、砧木等，以及其它仁果类植物。

二、监测时间

1. 果园。发生县在果树开花期到果实膨大中期(一般为 4月—7 月)，尤其是雨后或浇水后，每 15 天调查一次;秋花、秋果或秋稍期(一般为 9 月)调查 1 次。未发生县全年踏查 2 次。

2. 采穗圃或苗圃。全年踏查 2—3 次。

三、监测方法

在访问调查和踏查基础上，对发现疑似疫情的果园、采穗圃或苗圃，按以下方法进行重点监测。

(一)取样方法

1. 果园。果园面积小于 50 亩的设臵 1 个标准地进行调查，面积每增加 50 亩增设 1 个标准地，标准地面积不少于 5 亩，在标准地内随机抽取或采取平行线法选取寄主树作为调查株。每个标准地调查株数不少于 100 株。标准地累计面积原则上不应少于— 3 —总面积的 5%，抽取标准株不少于标准地总株数的 20%。

2. 采穗圃或苗圃。每个采穗圃或苗圃采用对角线取样或棋盘式取样，选取若干个样方(靠近圃地边缘的样方应距离边缘 2—3 米)。样方累计面积不少于栽培面积的 3%。样方应在 10 平方米以上，每个样方上的植株应在 100 株以上。每个样方按对角线取样或棋盘式取样，选取调查样株，调查样株不少于样方总株数的 10%。对于大苗或绿化苗，可适当扩大样方面积和抽样比例，也可采取随机抽取样株的方法进行，但样方累计面积不少于栽培面积的 3%，样株数量不少于苗圃估计总数量的 10%。

(二)调查方法

1.开花期。重点调查是否有花腐症状。花腐初期为水渍状病斑，花基部或花柄呈暗色，逐渐变褐色或黑褐色，不久萎蔫。病菌可由单朵花扩展至花梗及花簇中其它的花。在温暖潮湿的条件下，花梗上会有菌脓渗出。

2.果实膨大期。重点调查嫩梢、枝干、果实症状。嫩梢最易受侵染，最初症状是梢表皮发黑，后叶片、枝尖萎蔫，但萎蔫前不褪色，呈拐杖状，潮湿时，枝条、叶柄上出现菌脓，几天内即可造成整枝的死亡。随着病菌不断深入和侵染主干，皮层收缩、下陷，会形成溃疡斑。幼果在感病初期果实呈水渍状，湿度大时可见大量乳白色至褐色的菌脓，发病后期变黑褐色，呈僵果状。

3. 苗期。重点调查嫩梢是否出现“牧羊鞭”症状。

四、鉴定方法

(一)样品采集。将田间调查发现疑似症状的植株进行取样，若有条件，可采用梨火疫病快速检测试纸条做初筛，阳性样品作为重点样品进行实验室检测。采集样本装在牛皮信封内，记录采集时间、地点、采集人、发病症状及发病面积等信息。

(二)免疫学检测。采用商品化 ELISA 方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。若检测结果为阴性，判定为未检出梨火疫病菌。若检测结果为阳性，且有典型症状，判定为检出梨火疫病菌;若检测结果为阳性，而症状非典型，需进行分离培养及致病性测定鉴定。

(三)分子生物学检测。根据实验室条件，可选择 PCR 凝胶电泳检测、实时荧光 PCR 检测等。检测结果若为阴性，判定为未检出梨火疫病菌。若检测结果为阳性，且有典型症状，判定为检出梨火疫病菌;若检测结果为阳性，而症状非典型，需进行分离培养及致病性测定鉴定。

(四)分离培养鉴定。将制备样品悬浮液或样品富集培养液，在 LB 培养基平板上划线分离，菌落白色，较大而凸起。在 25℃恒温培养 24 —48 小时，挑取可疑单菌落进行纯化，转接 2—3次，随后进行致病性测定、Biolog 鉴定、免疫学或分子生物学鉴定。

(五)Biolog 鉴定。利用 Biolog 微生物自动鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定，按照说明书进行操作及结果判定。

(六)致病性测定。根据实验室条件，可选择杜梨苗、未成熟梨幼果接种试验或枝梢接种试验，进行致病性测定。调运相关物品的梨火疫病菌检测参照上述方法进行。

五、结果记录与保存

田间调查结果填入《梨火疫病菌田间调查记录表》(附表)，调查结果和检测样品妥善保存于植物检疫机构备查。

来源：全国农技中心